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碳曲霉中环化酶基因参与赭曲霉毒素A生物合成的证据

来源:https://doi.org/10.3390/toxins13120892发布时间:2022-01-12

真菌毒素预警和防控
 

碳曲霉中环化酶基因参与赭曲霉毒素A生物合成的证据

Evidence of the Involvement of a Cyclase Gene in the Biosynthesis of Ochratoxin A in Aspergillus carbonarius


摘要:赭曲霉毒素A (OTA)是一种广为人知的真菌毒素,广泛分布于食品和饲料中。真菌基因组测序在鉴定已知和新化合物的次生代谢物基因簇方面具有巨大的效用。对斯氏链霉菌、westerdijkiae曲霉、黑曲霉、碳青霉和诺丁假单胞菌的OTA生物合成集群比较分析显示,在五个结构基因(otaA、otaB、ota、otaR1和otaD)中的OTA集群组织具有高共线性。此外,最近对曲霉属OTA产毒菌的基因组进行了详细的比较分析,鉴定了位于otaA和otaB基因之间的OTA簇中的环化酶基因otaY,其编码与SnoaLs结构域高度相似的预测蛋白质。在链霉菌产生的聚酮化合物抗生素的生物合成中,这些蛋白质催化闭环环节。在本研究中,我们证明了在产生OTA条件下,碳青霉环化酶基因上调,这与其他OTA簇基因的表达趋势以及基因完全缺失在OTA生物合成中的作用一致。我们的结果首次指出了一个环化酶基因参与了OTA生物合成途径。它们代表了在理解碳青霉OTA生物合成分子基础上向前迈进了一步。
 
关键词:OTA,生物合成的集群,SnoaL结构域,聚酮环化酶

 
       OTA是一种众所周知的真菌毒素,广泛分布于食品和饲料中,包括谷物制品、葡萄和副产品、咖啡、饮料、可可、坚果、干果和腌肉。赭曲霉毒素A是一种次级真菌代谢产物,由曲霉属和青霉属的许多种产生,且具有多种毒理学效应。碳曲霉菌是其中一种主要的OTA产毒菌,其不仅具有高产毒能力和高比例产毒菌株,同时它还是全世界葡萄园污染葡萄的主要菌种。
       真菌基因组测序对于识别已知和新化合物的次级代谢物基因簇具有很大的实用价值。对斯氏链霉菌、westerdijkiae曲霉、黑曲霉、碳青霉和诺丁假单胞菌中OTA生物合成簇的比较分析表明,它们具有高共线性。最近,通过对曲霉基因组的详细比较分析,我们发现了一种基因,其序列编码一种类似于细菌聚酮环化酶的预测蛋白。该基因位于otaA和otaB基因之间的OTA簇中;它存在于所有目前测序的产OTA真菌的基因组序列中,并被假设参与OTA的产生。特别是,该基因编码一种与SnoaLs结构域高度相似的蛋白质。
       CRISPR–Cas9被细菌和古细菌用作防御病毒感染的手段,并已发展成为一种基因组编辑工具,可诱导靶向DNA双链断裂(DSBs)。该基因编辑系统由两部分组成:Cas9核酸酶和一个单链RNA(sgRNA),驱动Cas9/RNA复合物到达特定的靶点。一旦DNA双链在靶位点被Cas9核酸酶活性切割,两端随后可通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)途径修复。由于CRISPR/Cas9具有简单、高效和一步引入多个基因突变的可能性等特点,在真菌方面,它已成为快速发展的基因组编辑工具。它已经发展成为一种强大的技术,已应用于各种丝状真菌,包括巢状芽孢杆菌和尖叶芽孢杆菌、米曲霉、烟曲霉、黑曲霉、炭疽菌、粗糙脉孢菌、交替链格孢菌、尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌。将Cas9/RNA复合物直接输送到细胞是该技术的最新进展之一。因此,用体外组装核糖核蛋白(RNPs)直接转化真菌原生质体,避免了在真菌宿主细胞中表达Cas9蛋白和为每个sgRNA组装特异表达的需要。当与靶向基因上游和下游区域的双体外组装Cas9–RNPs结合时,CRISPR/Cas9系统对于完全基因缺失就显得特别有效。
       在本研究中,我们使用CRISPR/Cas9方法通过完全基因缺失证明了otaY基因的作用。此外,还研究了环化酶基因的表达水平,以证明其与OTA积累动力学的相关性和其他OTA生物合成基因的表达。我们的研究结果首次指出了一个新的基因参与了碳曲霉中OTA的生物合成途径,代表了对OTA生物合成分子基础的进一步理解。这项技术的优点是最大限度地降低了修改相邻基因序列和瞄准彼此非常接近的聚集基因的风险。 
 

1. 基因表达分析

 
       我们研究了该环化酶编码基因相对于其他OTA生物合成簇基因在A.carbonarius5010组基因中多个时间点的表达。对otaY基因和其他OTA簇基因(otaA、otaB、otaC、otaR1和otaD)的qRT PCR分析表明,在OTA适宜条件下(即培养基和温度),A.carbonarius5010基因中的环化酶基因上调。此外,环化酶编码基因表达水平的调节与其他OTA簇基因在4dpi和7dpi时的表达趋势一致。

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Figure1  qRT-PCR analysis of OTA related genes in A. carbonarius ITEM 5010 at 18–31℃

2.  选择和分析∆otaY突变体

       
       为了删除环化酶基因otaY的编码序列,我们设计了两个sgRNAs,将Cas9 RNPs复合物定向到otaY编码序列的5'和3'-UTR区域。根据预测的PAM位点和sgRNA片段,选择了两个sgRNA:位于otaY起始密码子上游172 bp的SGRNAY_up和位于终止密码子下游32 bp的SGRNAY_dw。从野生型菌株获得扩增区域的测序,以及图2中所选菌株AC2021所代表的∆otaY突变菌株分别产生916 bp和292 bp的扩增产物,表明otaY基因完全缺失,并且在otaY缺失位点缺乏hygB抗性基因的整合。然而,所有分析的突变体都能够在hygB选择性培养基上生长,并且不产生OTA。此外,对扩增区的序列分析没有证据表明与otaY基因(otaA和otaB)相邻基因的UTRs调控区有任何序列改变。

 
Table1 sgRNAs used in this study
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3. 基因组测序

       
       对所选∆otaY突变株AC2021的基因组进行测序,与A.carbonarius第5010项的序列基因组进行了比较分析发现otaY基因在野生型菌株原始支架_12的951737和952362位置之间发生完全缺失,导致突变菌株中缺失624bp。删除的染色体片段包括全部otaY基因,与PCR分析和Sanger测序的预测缺失位点区域一致。对环化酶基因周围的otaA和otaB基因的UTRs区域进行分析,以及对OTA簇的整个基因组区域进行序列分析,未发现该基因中的任何其他核苷酸修饰∆otaY突变株。hygB基因的整合并没有改变围绕hygB整合位点的基因编码序列。 
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Figure2  PCR amplification from genomic DNA of deletion site from wild-type ITEM 5010(1)
and AC2021 ∆otaY mutant strain(2).M = 100bp ladder

4. ∆otaY突变株OTA簇基因的表达分析

       
        在MM琼脂培养基上进行4dpi后,对菌株5010和AC2021中OTA簇基因转录的RT-PCR分析显示,野生型菌株5010中表达了全套基因,而只有突变菌株AC2021中没有。

 
Table2 Primers for qRT-PCR and RT-PCR used in this study
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       对otaA、otaB、otaC、otaR1和otaD基因的qRT PCR分析证实,otaY基因的缺失不会阻止或显著改变其他OTA簇生物合成基因的表达。
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Figure3  qRT-PCR analysis of OTA related genes in the wild-type ITEM 5010 and AC2021∆otaY mutant strain of A. carbonarius 
 

5. OTA分析

 
         通过超高效液相色谱-荧光检测(UPLC-FLD),葡萄汁培养基(GJM)的水分活度达到0.99和0.93,温度在18/31℃,10h/14h暗/光周期下生长后,收集的菌丝体中产生OTA,在OTA适宜条件下,4dpi和7dpi分别为472.23ng/g和452.82 ng/g。在两个采集点的非适宜条件下,未在菌丝体中检测到OTA。 另外,分析了突变株中OTA,在25℃的MM琼脂上黑暗培养七天后显示,缺乏otaY基因培养物提取物中没有毒素。 色谱图清楚地显示了野生型菌株的稀释提取物中存在OTA,以及选择作为代表的AC2021突变菌株的稀释提取物中不存在OTA。另一个显著的峰在0.85min洗脱,出现在野生型色谱图中,这可能是OTA的前体之一。该峰也出现在突变菌株稀释提取物的色谱图中,但浓度要低得多。需要进一步的研究来确定这种化合物,它可能参与OTA的生物合成途径,以及它与otaY基因的关系。为了证实图4中所示的突变菌株即使在极低浓度下也不产生OTA,通过OTA特异性免疫亲和柱纯化和浓缩真菌提取物,并通过UPLC-FLD进行分析,未检测到OTA。 
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Figure4  UPLC-FLD chromatograms of OTA standard solution (1018 ng/g) (blue trace), extract of A.carbonarius wild-type strain ITEM 5010 (6467 ng/g) (black trace), and extract of A. carbonarius∆otaYdeletion mutant strain AC2021 (red trace). Retention times = OTA 1.72 min

6. 总结

 
     
         编码聚酮环化酶的新基因otaY在OTA生物合成中的作用首次通过CRISPR/Cas9介导的 A. carbonarius缺失得到证实。本文的发现确定了参与OTA生物合成的六个基因(otaA、otaY、otaB、otaC、otaD和otaR1)的核心簇。
 

 
 
Massimo Ferrara,Antonia Gallo,Carla Cervini,et al.Evidence of the Involvement of a Cyclase Gene in the Biosynthesis of Ochratoxin A in Aspergillus carbonarius.Toxins 2021, 13(12), 892.
 
 
 
全文链接:https://doi.org/10.3390/toxins13120892
 


 
 
文稿:吴俊迪        编辑:上官国莲            审核:王敬敬