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福建农林大学团队鉴定了黄曲霉中aflN在黄曲霉毒素的合成和分生孢子生成中的作用

来源:毒理学领域知名期刊《Toxins》(Q1,IF=4.546)发布时间:2022-03-26

真菌毒素形成和调控机制



aflN参与黄曲霉中黄曲霉毒素的合成和分生孢子的生成

aflN Is Involved in the Biosynthesis of Aflatoxin and Conidiation in Aspergillus flavus
 
摘要:黄曲霉因产生黄曲霉毒素而对社会经济和公众健康构成威胁。aflN是一个位于黄曲霉毒素基因簇中的基因,但黄曲霉中aflN的功能尚不明确。在本研究中,aflN被敲除并过度表达,以研究aflN的功能。结果表明,AflN的缺失导致黄曲霉毒素生物合成的缺陷。AflN也被发现在分生孢子中起作用,但在菌丝生长和菌核发育中不起作用。此外,AlfN与环境氧化应激反应和细胞内活性氧水平有关。最后,AflN参与了黄曲霉对宿主的致病性。这些结果表明,AflN在黄曲霉中黄曲霉毒素的生物合成、分生孢子和活性氧的产生中起着重要作用,这将有助于了解AflN的功能,并有助于黄曲霉和黄曲霉毒素污染的预防和控制。
       福建农林大学(Fujian Agriculture and Forestry University)生命科学学院福建省致病真菌与真菌毒素重点实验室通过对黄曲霉野生型、ΔAlfN突变体和互补型菌株的表型特征进行比较,揭示了AlfN发挥的毒素合成作用,并在期刊《Toxins》(IF=4.546)发表了相关的研究论文。

关键词:黄曲霉;AflN;黄曲霉毒素;分生孢子

 

1  位于细胞质中的AfIN在AFB1的合成中发挥作用

         与野生型黄曲霉WT和补充型aflN-com相比,突变株△afIN中几乎没有检测到AFB1,而在过表达型OE::afIN中AFB1明显增加,说明afIN在AFB1的合成中起着重要的作用(图1A)。
       蛋白质的位置与其生物功能有关,采用同源重排法将AfIN与绿色荧光蛋白(GFP)融合插入染色体中,发现AfIN在24h仍然分布在细胞质中(图1B),表明AfIN在细胞质中AFB1的合成中发挥着关键作用。

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图1 AfIN参与黄曲霉毒素的合成
(A) AFB1在WT、afINafIN-comOE::afIN中的相对含量。ND表示未检测到。小写字母不同表示差异显著 (p < 0.05)。
(B) 通过荧光显微镜检测alfN-gfp的表达,确定AfIN在黄曲霉中的位置。DIC表示差分干扰对比度。GFP代表绿色荧光蛋白。
 

2 AfIN参与分生孢子发育,但不参与菌丝生长和菌核发育

       为了研究AfIN在分生孢子发育中的作用,对不同菌株的分生孢子进行了研究。如图2A所示,WT、aflNaflN-comOE::afIN在形态上存在差异。与WT和afIN-com相比,aflN的分生孢子数量显著减少,OE::aflN的分生孢子数量显著增加。在YGT (酵母提取物,葡萄糖和微量元素) 和PDA (马铃薯葡萄糖琼脂) 培养基中都观察到了这一现象 (图2B),说明AfIN在分生孢子的发育中发挥了重要作用。为了研究AfIN是否在其他发育过程中发挥作用,对菌落直径进行了测量,图2C的结果显示aflNafIN-comOE::aflN之间没有差异。
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图2 AfIN在分生孢子和菌丝生长中的作用
(A) WT、△aflNaflN-comOE::aflN菌株在YGT和PDA上生长的菌落形态。(B) WT、△aflNaflN-comOE::afIN孢子数量的比较。
(C) WT、△aflNaflN-comOE::afIN菌丝生长的比较。
 

afIN的缺失导致黄曲霉对氧化应激的敏感度降低

       AfIN作为细胞色素P450酶,与黄曲霉氧化还原系统密切相关。为了研究AfIN在氧化应激反应中的作用,研究了不同菌株在H2O2作用下黄曲霉的生长。如图3A,B所示,△aflN菌株对2.5 mM H2O2的敏感性低于WT和aflN-comOE::afIN对H2O2更敏感,表明aflN参与了对氧胁迫的响应。细胞内活性氧 (ROS)水平在一定程度上反映了氧化应激状态。如图3C,D所示,△aflN中ROS水平显著高于WT和aflN-com。相反,OE::aflN株的ROS水平较低,表明活性氧清除酶与△aflN中活性氧水平的升高有关。
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图3 aflN在氧化应激中的作用
(A) 分别用1 mM H2O和2.5 mM H2O2处理菌株。(B)  H2O2处理后WT、△aflNaflN-comOE::aflN菌株的生长抑制率比较。
(C) 不同菌株DCFH-DA染色显示ROS信号。(D) 不同菌株的ROS信号定量分析。
 

4  AfIN在黄曲霉对作物种子致病性中起重要作用

       通过对花生和玉米的侵染,研究了黄曲霉的致病性。如图4A所示,在接种后第5天观察花生和玉米的侵染情况,结果表明,△aflN的侵染量小于WT和aflN-com,而OE::afIN的侵染量大于WT和aflN-com。如图4B,C所示,与WT和aflN com株相比,△aflN侵染花生和玉米中几乎没有检测到AFB1,而OE::aflN侵染的AFB1明显增加。同时对花生和玉米的孢子数量进行了定量分析。如图4B,C所示,△aflN侵染花生和玉米的分生孢子明显少于WT和aflN-com菌株,而OE::aflN侵染花生和玉米的分生孢子明显多于WT和afIN-com菌株。这些结果表明,AfIN在黄曲霉对作物种子的致病性中起重要作用,缺乏AfIN会导致其致病性减弱。
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图4 afIN基因对黄曲霉致病性的影响
(A) 花生和玉米不同菌株的侵染。Mock表示没有任何黄曲霉株感染的对照。(B) 花生被侵染后的分生孢子数和AFB1的相对量。
(C) 侵染玉米的分生孢子数和AFB1的相对数量。小写字母不同表示差异显著 (p < 0.05)。

       综上所述,afIN参与了黄曲霉的合成、氧化应激反应、分生孢子和致病性的生理活动,但不参与其生长和菌核的形成。这些研究有助于人们更好地了解黄曲霉aflN在黄曲霉中的功能,为科学防治黄曲霉提供参考。

 
Jia K, Yan L, Jia Y, Xu S, Yan Z, Wang S. aflN Is Involved in the Biosynthesis of Aflatoxin and Conidiation in Aspergillus flavus. Toxins (Basel). 2021 Nov 22;13(11):831. doi: 10.3390/toxins13110831. PMID: 34822615; PMCID: PMC8617700.
 
全文链接:https://doi.org/10.3390/toxins13110831  



  
文稿:黎铭轩         编辑:上官国莲          审核:马艳玲