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溶杆菌CW239对赭曲酶毒素A的降解其新型降解基因羧肽酶cp4*的特性研究

来源:https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31843237/发布时间:2022-05-13

真菌毒素检测和脱毒



 

溶杆菌CW239对赭曲酶毒素A的降解新型降解基因羧肽酶cp4*的特性研究

Detoxifification of ochratoxin A by Lysobacter sp. CW239 and characteristics of a novel degrading gene carboxypeptidase cp4*


摘要赭曲霉毒素A(OTA)是一种霉菌毒素,经常污染农业产品,威胁食品安全。从溶菌杆菌属分离出一种高效的OTA降解菌株CW239。研究了CW239对OTA的降解特性。并从CW239中成功克隆并表达了一种新的OTA降解基因羧肽酶cp4。将重组cp4基因片段克隆到pET-32α(+)表达载体中,在大肠杆菌 BL21(DE3)中进行蛋白质表达纯化。得到了重组蛋白rCP4。并对其OTA降解活性进行研究。

关键词赭曲霉毒素A;基因克隆;羧肽酶

 

降解菌株CW239的分离与鉴定

       采用富集法分离出具有对OTA的高效降解活性的菌株CW239。克隆并分析了CW239的16SrRNA基因序列(1481bp),构建了系统发育树。如图1结果显示,CW239是溶杆菌属的一个成员。
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图1  菌株CW239的系统发育树和形态学特征
(A)邻域连接系统发育树(B)CW239在TSA上培养12h的单个细胞的电镜图 5.0um(C)在37°C的TSA上培养生长24小时的CW239菌株

       降解实验表明(图2),菌株CW239(2%接种剂量)与OTA(30mg/L)共同孵育24h,降解OTA的降解率为86.2%)。降解后,OTA残留(4.04mg/L)低于中国对食品和饲料中OTA的限量标准( GB27612017,2017) 。
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图2  OTA被菌株CW239降解后的产物
(A)OTA与(●)CW239和(■)BL21(DE3)共同培养24小时后,在培养基中检测到的OTA残留物;(B)12小时OTA降解产物和OTA标品的色谱图。


重组羧基肽酶的克隆及表达

     
       根据具体溶菌杆菌的基因序列设计了 PCR引物,利用设计的引物和CW239基因组DNA克隆了CW239的羧基肽酶基因。以菌株CW239的基因组DNA为模板,通过PCR获得羧肽酶cp4的完整基因序列 (1218bp)。
       如图所示,将cp4基因在在大肠杆菌 BL21(DE3)实现了融合表达,并评估了该酶对OTA 的降解效果。PCR获得的DNA片段,用BamHI和HindIII酶切,并连接到表达载体pET-32a。将重组载体pET-32a导入大肠杆菌BL21CodonPlus™(DE3)。与阴性对照(50mMTris-HCl,pH7.0)相比,在总蛋白浓度为0.5mg/mL的条件时,粗rCP4酶液对OTA的降解率为36.8%。此外,还获得了一种与菌株CW239降解产物的HPLC峰相同的OTA降解产物峰。
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 图3  羧肽酶CP4的基因克隆、表达、蛋白质纯化和表达
(A)基因cp4的PCR产物的琼脂糖凝胶泳(M,DNA标记;第1道,空白对照;第2-3车道:cp4 PCR产物);
(B)重组质粒中cp4基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳(M,DNA标记;第1-2道,正变性PCR产物);
(C)SDS-PAGE分析显示重组CP4在大肠杆菌BL21中的表达(M,蛋白质标记;第1道,重组细胞中的沉淀物;第2道,重组细胞的上清液);
(D)SDS-PAGE分析纯化rCP4(M,蛋白质标记;第1巷,纯化rCP4);(E)rCP4对OTA降解效果(数据表示为平均±SD,*p < 0.05);
(F)48h内,纯化的0.5毫克/毫升rCP4蛋白在培养基中降解OTA和OTA降解产物的变化。

羧肽酶rCP4降解活性和生化特性

     
        如图4所示,羧肽酶rCP4在15-42°C下表现出相对较高的活性,最佳温度约为37°C;在pH值为4.0-8.0范围内最活跃。在实验中发现10%乙腈(ACN)、蛋白酶K、1%SDS或1.0mg/mL蛋白酶K加1%的SDS能显著抑制rCP4酶活性,但10%的乙醇对降解活性没有显著影响。Cu2+、Zn2+或Mn2+的二价金属离子以及EDTA或EGTA的金属螯合剂同样显著抑制了OTA降解活性;但Mg2+和Ca2+没有显著的抑制结果。
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图4 . rCP4的生化特性
A:温度范围和最适温度;B:pH范围和最佳pH;C:变性剂和蛋白酶K的影响;D:二价阳离子和金属螯合剂的影响。


降解产物分析

       
          由图5所示,在降解实验中,用0.5mg/L纯化的rCP4与OTA孵育48h后,OTA浓度降低了约0.05mmol/L。同时观察到等量的OTa产生。这一结果表明,降解的OTA已完全转化为OTa,无毒的OTa是降解体系中的最终降解产物。
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图5  由OTA和OTα的LC-MS/MS色谱图推测的降解途径
(A)可能的OTA降解代谢途径;(B)由纯化rCP4蛋白降解的OTA的色谱图;(C)OTA的ESI质谱图;(D)OTα的ESI质谱图。

总结


       本文分离并鉴定了一株高效的OTA降解菌株CW239,并对其OTA降解特性进行了研究。从CW239中获得一个新的羧基肽酶基因cp4,将cp4基因在在大肠杆菌 BL21(DE3)实现了融合表达,并评估了该酶对OTA 的降解效果。降解实验结果表明,rCP4降解OTA最终降解产物为无毒的OTa,与宿主菌株的降解产物一致。然而,菌株CW239的降解活性远高于异源产生的蛋白rCP4。该降解菌株的确切OTA降解机制有待进一步研究。



文稿:陈茹       编辑:上官国莲         审核:王敬敬