欢迎来到中国真菌毒素网! 今天是2022年06月30日 设为首页 加入收藏 中文版 ENGLISH 联系我们

科研动态

您当前的位置:首页 > 科研动态

芍药苷对黄曲霉的抗真菌作用及其对细胞壁和细胞膜的作用模式

来源:《LWT - Food Science and Technology》(IF=4.952)发布时间:2022-05-20

产毒真菌



芍药苷对黄曲霉的抗真菌作用及其对细胞壁和细胞膜的作用模式

Antifungal efficacy of paeonol on Aspergillus flavus and its mode of action on
cell walls and cell membranes
 
摘要:黄曲霉污染农产品和危害人类健康。植物衍生的天然化合物是一种潜在的抗真菌剂且效果优于化学杀菌剂。芍药苷能有效抑制黄曲霉的生长,通过检测一系列的表型变化来研究其潜在的抗真菌作用。通过表面超微结构的表征来观察细胞壁的损伤,并通过β-1、3-葡聚糖和几丁质含量的变化来定量。细胞膜完整性受损可通过碘化丙啶(PI)染色、测定细胞释放成分、相对电导率、pH值和细胞外金属离子(如K+和Na+)的含量来表明。除此之外,芍药苷能降低总脂质含量,诱导脂质过氧化,改变甘油含量,分解海藻糖。最后,还发现芍药苷能降低黄曲霉对花生和玉米粒的污染。2021年河南理工大学谢艳丽团队在《LWT - Food Science and Technology》(IF=4.952)发表了芍药苷对黄曲霉的抗真菌作用及其对细胞壁和细胞膜的作用模式的研究论文。

关键词:芍药苷;黄曲霉;抗真菌机制


1  黄曲霉对芍药苷的敏感性研究

     
        表1表示芍药苷的浓度对黄曲霉菌丝体的抑制率,SDA平板上的菌丝生长如补充图1所示,虽然0.16和0.31 mg/mL的芍药苷在24 h内对黄曲霉的生长有很强的抑制作用(抑制率大于95.60 %),但在48 h时对黄曲霉抑制率降低了很多(分别约为24.94 %和30.21 %)。在0.625、1.25和2.5 mg/mL浓度下,在24 h和48 h时芍药苷都能完全抑制黄曲霉生长。所以芍药苷对黄曲霉的最低抑菌浓度(MIC)为0.625 mg/mL。


表1  芍药苷对黄曲霉的抗真菌活性
\
\
补充图1  黄曲霉菌丝生长情况
 

2 芍药苷改变了细胞壁的超微结构


       细胞壁作为真菌的最外层屏障,对真菌的生存有着至关重要的作用,因为它可以对抗环境压力。为了确定芍药苷处理是否会改变细胞壁,该团队用扫描电镜对黄曲霉进行了超微结构表征。图1A显示,对照组的菌丝平直,细胞壁的表面覆盖着有序的纤维结构。在1/2 MIC组中,菌丝开始不规则地收缩,部分菌丝甚至出现肿胀现象。在暴露于MIC下时,菌丝明显扭曲变形,有些甚至出现破裂的现象。因此,芍药苷处理以剂量依赖的方式严重损害了细胞壁结构以及菌丝之间的连接。

3 芍药苷降低β-1,3-葡聚糖和几丁质的含量

       如图1B显示,对照组与1/4MIC组相比β-1,3-葡聚糖的含量没有明显变化。但1/2MIC组和MIC组与对照组相比则有显著下降,分别下降约为45.90 %和47.82 %,这两组间无明显变化。几丁质对照组含量约为33.52 %,1/4MIC、1/2MIC和MIC组与对照组相比显著下降分别为3.14 %、5.52 %和9.02 % (图1C)。几丁质除了分布在细胞壁外,还可以在细胞壁向菌丝中心局部延伸的过程中形成隔膜。如图1D所示,对照组的隔膜清晰、完整。0、1/4MIC组和1/2MIC组的隔膜无明显差异,但MIC的隔膜基本观察不到。由表2可知,与对照组相比,1/4MIC、1/2MIC和MIC组的隔膜数显著下降,分别下降为19.64 %、25.00 %和73.21 %。
\\
图1  芍药苷对黄曲霉细胞壁完整性的影响
(A)  扫描电镜观察菌丝形态;(B) 菌丝细胞壁中(B) β-1,3-葡聚糖和(C) 几丁质含量的定量分析;(D) 荧光显微镜下钙荧光白染色后芍药苷处理菌丝间隔的分布。
 
表2  钙荧光白染色后,用芍药苷处理的黄曲霉的隔膜数和还原率
\

芍药苷破坏了细胞膜的完整性表2  钙荧光白染色后,用芍药苷处理的黄曲霉的隔膜数和还原率

 
       为了阐明芍药苷对细胞膜完整性的影响,研究团队进行了PI染色、对细胞成分的释放、相对电导率和pH值进行测定。由表3可知,与对照组相比,用1/4MIC、1/2MIC和MIC处理的菌丝的荧光强度分别显著增加了约1.89、3.63和9.22倍。由表3中的细胞成分(如核酸和蛋白质,OD260)释放结果可以得知,MIC组的值约为对照组的2.81倍。从图2A可以看出,经芍药苷处理后的相对电导率迅速增加,MIC组增加得最快且最高,在最后一个时间点约为66.90 %。为了进一步阐明细胞外电解质泄漏后的酸碱性,研究团队测定了用0、1/4MIC、1/2MIC和MIC芍药苷处理后细胞外的PH。由此可知,芍药苷在MIC下可显著诱导细胞成分的泄漏,而细胞成分整体上呈酸性。综上所述,芍药苷对细胞膜的完整性具有严重的破坏作用。

表3  芍药苷对PI强度和细胞成分释放的影响
\

\
图2  芍药苷对黄曲霉菌丝(A)的相对电导率和(B)的胞外pH值的影响
 

芍药苷抑制K+的吸收,促进Na+的释放

       
       为了进一步确定离子通道对通过细胞膜运输的金属离子产生的变化,研究团队对细胞外环境中K+、Na+、Cu2+、Fe2+和zn2+的含量进行了定量。如图3A所示,对照组细胞外K+含量最低,且该含量与芍药苷浓度呈正相关。同时,MIC组的K+含量在所有黄曲霉培养基中最高,与SDB相似。0、1/2MIC和MIC间存在差异。在图3B中,Na+的含量在0、1/4MIC、1/2MIC和SDB组相似,这说明无论是否用芍药苷(+都处于相对平衡状态。令人惊讶的是,MIC表现出最高的Na+水平含量,这表明经MIC处理后释放了大量的Na+。同时,其它细胞外金属离子(如Cu2+、Fe2+、zn2+)的含量均接近于0。这些结果首次表明,参与K+运输进入细胞的通道可能被抑制,即使在低浓度下,Na+转运的平衡也只在MIC时受到干扰。
\

图3  芍药苷处理黄曲霉胞外(A) K+和(B) Na+的含量


芍药苷诱导的脂质过氧化反应可改变甘油含量,降低海藻糖含量


       为了进一步证明芍药苷所引起的脂质变化,研究团队测定了总脂质和MDA的含量。如图4A所示,对照组的总脂质含量为108.67 mg/g,与对照组相比1/4MIC组和1/2MIC组没有出现显著性的变化,但经过处理后MIC组的脂质含量显著降低了约46.21 %。MDA通常由脂质过氧化产生,是反映生物体过氧化水平的关键参数。如图4B所示,随着芍药苷浓度的增加,MDA含量显著增加,且呈剂量依赖性。MIC组增加最大,MDA含量约为对照组的两倍,结合总脂质和MDA含量的结果,芍药苷处理能增加MDA含量和降低总脂含量。
       在高渗透压下,高渗透压甘油(HOG)途径通常被激活,这导致酵母和丝状真菌中甘油含量的积累。如图4C所示,对照组的甘油含量约为17.83 μg/mg。虽然1/4MIC和1/2MIC芍药苷处理的黄曲霉菌丝增加,分别为7.29 %和10.81 %,但MIC的芍药苷处理后出现明显的下降,下降程度约为64.68 %。
       为了表征芍药苷对海藻糖的影响,研究团队对其含量进行了定量分析,结果如图4D所示。芍药苷可降低海藻糖含量,且呈剂量依赖性。其中,芍药苷的1/4MIC、1/2MIC和MIC显著降低,海藻糖的含量降低约21.68 %、41.51 %和68.19 %。由于海藻糖在真菌、细菌、植物和昆虫中是一种独特的成分,在哺乳动物细胞中不存在,所以它可以作为抗真菌药物的潜在靶点。

\
图4  测定芍药苷处理后黄曲霉菌丝中
(A) 总脂质       (B) MDA       (C) 甘油       (D) 海藻糖的含量

芍药苷抑制花生和玉米粒上黄曲霉的生长


       花生和玉米作为两种对黄曲霉反应最敏感的作物,通常被用来评估抗真菌药物的效果。黄曲霉在花生和玉米粒上的生长情况如补充图3所示。24 h内,除两个MIC组外,其余各组花生和玉米粒上的菌丝均开始生长。72 h时,0、1/4MIC和1/2MIC组花生均被黄曲霉完全污染,而MIC组花生均未被污染。1/2MIC和1/4MIC组黄曲霉在玉米粒上的生长能力不如花生强。由图5进一步可知,黄曲霉在1/4MIC和1/2MIC下(分别为93.33 %和70.00 %)的污染率不一致,72 h(两者都是100.00 %)。总之,MIC下的芍药苷能有效降低黄曲霉对花生和玉米粒的污染。
 
\
补充图3  黄曲霉在花生和玉米粒上的生长情况
\
图5  黄曲霉对(A) 花生和(B) 玉米粒的污染率
 

结论


       植物来源的芍药苷对黄曲霉具有较强的抑制作用。芍药苷的抗真菌作用可能是通过减少β-1,3-葡聚糖、几丁质和纤维结构的合成以及干扰金属离子的运输,诱导脂质过氧化和分解海藻糖,从而损害细胞壁和细胞膜的完整性。但是,芍药苷准确的抗真菌靶点和是否干扰HOG或呼吸途径还需要进行进一步的研究。

Qian Li , Ying Zhao , Xiaoman Zhu , Yanli Xie.(2021) Antifungal efficacy of paeonol on Aspergillus flavus and its mode of action on cell walls and cell membranes[J]. LWT - Food Science and Technology,149:111985.
  
 
文稿 :何甜甜       编辑:上官国莲       审核:马艳玲